在1940年的八路军百团大战中，周希汉担任一二九师三八六旅参谋长，并被任命为左翼纵队司令员。他率领该旅十六团、决死队二十五团、三十八团，以及榆次、太谷两个县大队、两个工兵加强连，共计1万多名民工，承担了寿阳至榆次段铁路的破袭任务。

8月30日，日军集结重兵对八路军一二九师的晋中羊儿岭地区展开“扫荡”，企图围歼该师指挥机关。羊儿岭位于山西寿阳、昔阳、和顺三县交界处的和顺县境内，地势险要，是附近山区的制高点。在了解马坊、京上已被日军占领，而师部医院仍在卷峪沟未转移的情况下，周希汉果断决定：十六团在羊儿岭、上密岩线占领阵地，阻击北面跟踪之敌;三十八团留一个营监视马坊之敌，主力向东面的东大足一带转移，掩护十六团向东转移。

9月3日6时30分，日军1000余人在马坊之敌配合下，向羊儿岭八路军阵地发起猛攻。十六团英勇抗击，击退日军3次进攻，毙伤日军百余人，确保了万余名民工的安全转移。然而，敌人集中火炮和飞机向羊儿岭主峰猛烈轰击，八路军一度处于不利态势。周希汉迅速召集各部队发起反攻，成功夺回主阵地。随后，部队准备应对敌人反扑，采取“少摆多屯”部署，以1/3的兵力坚守阵地，2/3的兵力作为预备队隐蔽待命。

在接下来的战斗中，周希汉指挥部队英勇抗击，从2日早上6点半到晚上9点半，激战15小时，打退了敌人十余次冲锋，共毙伤日军300余人。当晚9时30分，周希汉接到上级命令，部队开始向东转移。